一份大鼠IL-6 ELISA说明书
一、用途
本试剂盒用于定量检测大鼠血清中的IL-6的浓度。
二、原理
本试剂盒采用双抗夹心ELISA法。抗大鼠IL-6单抗包被于酶标板上,大鼠标本中的IL-6会与单抗结合。加入生物素化的抗大鼠IL-6(二抗),它将与结合在单抗上的大鼠IL-6结合而形成**复合物,未结合的将被洗去。辣根过氧化物酶标记的Streptavidin将与二抗的生物素结合,多余的物质会被洗掉。加入TMB显色。大鼠IL-6的浓度与OD(450nm)成正比。
三、试剂盒组成
酶标板(Coated Wells)
48wells
Anti-rat IL-6RBiotin
1 vial
浓缩洗涤液(100X)(Washing Concentrate)
5ml
标准品(Standards)
1 vial
显色液(TMB Substrate)
6ml
标准品稀释液(Standard Diluent)
7ml
终止液(Stop Solution)
5ml
浓缩酶联物(HRP)
1 vial
酶联物稀释液(HRP Diluent)
7ml
生物素稀释液(Biotin Diluent)
7ml
四、需要但未提供的材料
1、 可在450nm处进行读数的酶标仪;
2、 能**吸取10-200µL的移液器;
3、 可调多道(8)移液器(50-200µL);
4、 供可调多道移液器使用的试剂存放槽;
5、 洗瓶或洗板机;
6、 蒸馏水或去离子水;
7、 1升的圆柱形量筒;
8、 血清移液器:1和(10或25 mL);
9、 移液器枪头;
10、 纸巾;
11、 计时器,用以监控温育步骤;
12、 处理池和**剂(例如:0.5% 次氯酸钠, 10% 家用漂白水);
五、注意事项
1、 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2、 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入HRP或底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3、 消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。
4、 底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用。
5、 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6、 在储存和温育时避免强光直接照射。
7、 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8、 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
9、 不能使用过期产品。
10、 如果可能传播**,所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置。
六、保存
贮藏于2-8°C.
样品:
在此检测中,可使用血清样品。
七、准备工作
1、 浓缩洗涤液(100X)用双蒸水稀释成1X(至1000ml)。
2、 标准品用1ml标准品稀释液复溶。得到10ng/ml的高浓度标准品。高浓度标准品可保存于-20°C.
3、 将10ng/ml的高浓度标准品稀释成一组标准品,如: 5, 2.5, 1.25, 0.625,0.3125,0ng/ml.
4、 配制1x HRP:一支 HRP加入6 ml 酶联物稀释液,混匀。1x HRP*好在临用前15分钟配制。
5、 配制1x Biotin:一支Biotin anti rat IL-6加入6 ml Biotin稀释液,混匀。1xBiotin*好在临用前15分钟配制。
八、操作步骤
试剂盒应平衡至室温(20-25°C )再试验。
取出所需反应板,临用前15分钟配制工作液
1、 加入100ul标准品(Standards)、100ul血清于相应反应板孔中。
2、 轻轻混匀30秒,封住板孔,37°C温育 60分钟。
3、 洗板:甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350ul洗涤液),并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干);反复洗涤5次。
4、 每孔加入100ul 1x Biotin.轻轻混匀30秒,封住板孔,37°C温育 60分钟
5、 洗板:甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350ul洗涤液),并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干);反复洗涤5次。
6、 每孔加入100ul 1x HRP.轻轻混匀30秒,封住板孔,37°C温育 30分钟
7、 洗板:甩尽板内液体,用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350ul洗涤液),并去除水滴(在厚叠吸水纸上拍干);反复洗涤5次。
8、 每孔加入100ul TMB显色液, 轻轻混匀10秒,37°C暗处温育15±10分钟。
9、 每孔加入100ul终止液(Stop Solution)。轻轻混匀30秒;30分钟内在450nm处读OD值。
以OD值为纵坐标,以标准品浓度为横坐标,绘制标准曲线。根据血清样品的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
九、举例
十、注意事项
1、作标准曲线时,要扣除标准品稀释液造成的本底;如果标本用标准品稀释液稀释,也要扣除标准品稀释液造成的本底,如果标本未用标准品稀释液稀释,标本不需扣除标准品稀释液造成的本底。
2、 生物素(Biotin anti rat IL-6) 和浓缩酶联物(HRP)用前应离心,使液体位于管底。